Иммуноблоттинг что это такое

Иммунологические методы

Исходя из названия, можно подумать, что иммунологические методы участвуют в борьбе с патогенами. Ничего подобного. Название свое эти методы получили потому, что основным действующим лицом в них является антитело — центральный белок иммунной системы. У человека и животных антитело выполняет важную функцию — распознает чужеродную молекулу, которая вторглась во владения организма, как непрошеный гость. По-научному такие молекулы-чужаки называют антигенами. А умение антител распознавать особые антигены называется специфичностью.

В какой-то момент ученые поняли, что если антитела умеют специфично узнавать различные антигены, то можно это их свойство использовать в собственных, научных интересах. Так исследователи в своих лабораториях стали получать антитела с заданной специфичностью — очень избирательно узнающие один, определенный, нужный исследователям антиген, и ничего больше. И это стало огромным прорывом.

Представьте, например, что нам нужно исследовать опасный белок, который вырабатывают только раковые клетки и не вырабатывают здоровые. Антитело к этому белку — своеобразная «удочка», которая ловит только его и никого больше. Выловив на антительный «крючок» нехорошую молекулу, мы можем внимательно ее изучить, сделать какие-то важные выводы о ее функционировании, определить концентрацию, попытаться найти слабые места, чтобы в дальнейшем сделать против нее лекарство. Можем обнаружить все производящие ее клетки (в нашем случае — раковые!) — их распространение, количество и так далее.

Можно антитела использовать и для других, более сложных, целей. Например, к ним можно «пришивать» разноцветные флуоресцентные молекулы, а потом «сажать» на соответствующие антигены. В результате эти антигены станут светиться, и мы сможем изучать взаимодействия важных молекул даже в живой клетке. Также использование антител позволяет изучать и такие белки, которые связаны с ДНК и оказывают непосредственное влияние на процесс транскрипции.

Как правило, методы, которые в качестве инструментов используют антитела, несут в своем названии приставку «иммуно-»: иммунопреципитация, иммунохроматография, иммуноферментный анализ (рис. 1). Именно о таких методах мы и расскажем в этой статье.

История развития иммунологических технологий

Рисунок 1. Несколько вех на пути развития иммунологических технологий.1890 г. — Беринг и Китазато открыли антитела — один из основных компонентов иммунного ответа организма. 1937 г. — Тиселиус и Кабата начали изучать молекулярную структуру антител. 1941 г. — Альберт Кунс разработал метод иммуногистохимии [1]. С тех пор метод прошел множество модификаций и усовершенствований, однако принцип его работы остался неизменным. 1966–1969 г. — Стратис Аврамис разработал методику пришивания ферментов к антителам (чуть позже вы поймете, насколько это важно) [2]. 1971 г. — Питер Перлман из Стокгольмского университета и Антон Шурс из Нидерландов независимо друг от друга разработали метод иммуноферментного анализа [3], [4]. 1975 г. — Сезар Мильштейн и Жорж Келер разработали метод гибридом — методику промышленного получения антител к определенному антигену (моноклональных антител). 1979 г. — Гарри Тобин из Института Фридриха Мишера разработал метод вестерн-блоттинг [5]. 1985 г. — Джордж Смит разработал методику фагового дисплея [6]. Позднее, в 1990-х годах, ее оптимизировали другие исследователи. 1999 г. — Разработали метод ChIP-chip для определения распределения когезина вдоль хромосомы III у делящихся дрожжей [7]. 2007–2008 г. — Появился и вошел в обиход метод ChIP-sequence [8].
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

рисунок Ольги Пташник

А теперь, когда мы овладели всей подготовительной информацией, пришло время перейти собственно к иммунологическим методикам.

Уникальное свойство антител — возможность налипать только на соответствующие антигены — делает их своего рода «волшебными магнитами» в руках биотехнолога. С помощью антител можно обнаруживать нужные молекулы (как правило, белки) среди ненужных; выделять эти нужные молекулы, очищать их, определять их количество и так далее.

Иммунопреципитация — способ, с помощью которого можно выделить из смеси и осадить (precipitate) ту молекулу, которая нас интересует (как правило, это белок; назовем его «Белок Х»).

Схема иммунопреципитации

Рисунок 6. Анимированная схема иммунопреципитации. Пояснения — в тексте.

рисунок Ольги Пташник

Последовательность действия при иммунопреципитации такова (рис. 6):

  1. Получаем антитела к нашему Белку Х (о том, как это сделать, подробно рассказано в разделе «Фабрика инструментов»).
  2. Закрепляем эти антитела на каком-нибудь твердом носителе, как правило, агарозной смоле (см. раздел «Ловушки для антител»). А в последнее время все чаще используют магнитные частицы — они очень удобны, их можно с помощью обычного магнита отделить от раствора. «Пришивание» антитела к носителю — отдельная тема: для этого можно сперва облепить носитель специальными белками (A и G), которые умеют крепко связываться с Fc-участком антител (рис. 2), а можно использовать специальную агарозу, которая «ловит» антитела на торчащие альдегидные группы (рис. 3).
  3. Помещаем антитела на носителе в исследуемый раствор (таким раствором могут быть, например, перемолотые клетки — лизаты, или плазма крови), чтобы на антитела налипли молекулы Белка Х (и только они!).
  4. Выуживаем носитель с антителами и налипшими на них молекулами Белка Х (чем-то это напоминает сказку про репку, где бабка тащила за дедку, а внучка — за бабку), промываем от ненужных молекул и элюируем (то есть, с помощью специального буфера отлепляем от антител и собираем в отдельной пробирке).

Коиммунопреципитация похожа на иммунопреципитацию, только немного сложней. Она предназначена для выделения антигена вместе с белками, которые с ним связаны. В таких случаях известный антиген называют белком-приманкой (bait protein), а белки, с которыми он взаимодействует, белками-жертвами (prey protein(s)). Жертвами могут быть структурные белки, сигнальные молекулы, кофакторы и т. д.

Действующие лица

Иммуноблоттинг что это такое

В этом разделе мы представляем вам главные молекулы-инструменты, используемые в иммунологических методах.

Антитела

Антитело, или иммуноглобулин, — это крупный белок, состоящий, как правило, из двух тяжелых и двух легких цепей. Тяжелые и легкие цепи, в свою очередь, состоят из вариабельных (V) и константных (С) доменов. Тяжелые цепи содержат один вариабельный (VH) и три константных домена (СH1, СH2, СH3), легкие цепи — один вариабельный (VL) и один константный (СL) домены (рис. 2) [9].

Строение антитела

Рисунок 2. Строение антитела. Вариабельные домены легкой и тяжелой цепей (VH и VL) вместе с ближайшими к ним константными доменами (CH1 и CL1) образуют Fab-фрагменты антител (fragment antigen binding). Именно этими фрагментами антитело «цепляется» за свой антиген. Остальную часть, представленную C-концевыми константными доменами тяжелых цепей, обозначают как Fc-фрагмент (fragment crystallizable), которым антитело может цепляться за Fc-рецепторы, расположенные на некоторых иммунных клетках. На границе Fab и Fc фрагментов располагается гибкая «шарнирная область», благодаря которой фрагменты антитела могут двигаться друг относительно друга; эта область содержит дисульфидные связи, соединяющие тяжелые цепи между собой [9].

рисунок Ольги Пташник

Каждое антитело распознает свой антиген и только его. А вот на каждый антиген может быть множество разных антител, которые распознают разные его участки (эпитопы). Разные антитела на один антиген называются поликлональными, то есть, состоящими из множества клонов — популяций антител. А идентичные друг другу, одинаковые молекулы антител называют моноклональными[10].

Поликлональные антитела куда дешевле и проще в производстве, чем моноклональные, но в иммунологических методиках чаще используют моноклональные, потому что они — абсолютно одинаковые молекулы, они гарантированно распознают один и тот же участок одного и того же антигена и потому гораздо стабильнее ведут себя в иммунологических методиках.

Антитело по своей структуре — эдакий Тянитолкай. С одной стороны у него находится связывающая антиген область (Fab-фрагмент), с другой стороны — «хвосты» тяжелых цепей — Fc-фрагмент. И для некоторых задач исследователю выгодно использовать не всё антитело, а лишь какую-то его часть. Так, можно взять Fc-фрагмент и пришить к нему какую-то другую молекулу (например, главный комплекс гистосовместимости (MHC)).

Иммуноблоттинг что это такое

Это увеличит время жизни молекулы в сыворотке крови и позволит связываться с рецепторами для антител (Fc-рецепторами). А можно использовать лишь Fab-фрагмент или комбинировать Fab-фрагменты различной специфичности, создавая так называемые биспецифические антитела. Кроме того, можно использовать не весь Fab-фрагмент, а лишь пару вариабельных доменов антитела и также комбинировать их. На рисунке 3 представлены различные варианты таких конструкций.

Конструкции на основе комбинаций фрагментов антител

Рисунок 3. Конструкции на основе комбинаций фрагментов антител. Исходные антитела нарисованы слева сине-зеленым и оранжево-розовым. Пояснения — в тексте.

рисунок Ольги Пташник

Их фрагменты и комбинации представляют собой:

  • Fab — отдельно применяемый антигенраспознающий фрагмент антитела.
  • F(ab’)2 — двойной антигенраспознающий фрагмент антитела с кусочком шарнирного участка.
  • Fab’ — антигенраспознающий фрагмент антитела с кусочком шарнирного участка. Эти три молекулы меньше размером, чем целое антитело, и поэтому более «юркие», лучше проникают в ткани и в некоторых случаях работают лучше полноценных антител. Такие фрагменты получают из целых антител, разрезая их специальными ферментами.
  • scFv — одноцепочечный вариабельный фрагмент — только сам антигенраспознающий участок антитела, ничего лишнего. Он модифицирован так, чтобы состоять из одной белковой цепи, а не из двух, как в антителе. Благодаря этому scFv не требует сложной посттрансляционной сборки, и его можно производить в бактериальных клетках, а это — самый простой и дешевый способ биотехнологического производства. Очень легкая и удобная молекула для иммунологических методик.
  • di-scFv — двойной одноцепочечный вариабельный фрагмент. То же, что предыдущее, только в двойном экземпляре. Работает чуть активнее, но и весит в два раза больше.
  • sdAB — однодоменное антитело. Самая миниатюрная молекула из всех присутствующих. Представляет собой только вариабельный участок тяжелой цепи особых антител, которые наряду с классическими антителами присутствуют в крови у верблюдовых и у некоторых видов хрящевых рыб. Также можно получать sdAb, разделяя димерный вариабельный домен классического антитела на меньшие по размеру мономеры. Такие молекулы легки в производстве и неплохо работают.
  • Трифункциональное антитело — представляет собой «химеру» из двух разных антител и имеет три сайта связывания: антигена 1, антигена 2 и Fc-рецептора.
  • Химически связанное F(ab)2 — сшитые между собой Fab-фрагменты двух разных антител.
  • BiTE (Bi-specific T-cell engager) — очень изящная искусственно выработанная молекула, представляющая собой одну белковую цепь, которая после трансляции сворачивается в два вариабельных участка двух разных антител.

Ловушки для антител

Ловушки для антител

Рисунок 4. Ловушки для антител — носители, на которых можно надежно закрепить антитела. Пояснения — в тексте.

рисунок Ольги Пташник

Иммуноферментный анализ

Схема иммуноферментного анализа

Рисунок 7. Анимированная схема иммуноферментного анализа. Пояснения — в тексте.

рисунок Ольги Пташник

  1. Получаем антитела к Белку Х.
  2. Добавляем исследуемый раствор (клеточный лизат, плазму крови или что-то еще) в лунку специального планшета из адгезивного пластика(см. раздел «Ловушки для антител»). Адгезивный — значит такой, к которому крепко прилипают белки. Белки из нашего раствора закрепятся на лунке планшета, и даже если мы теперь промоем лунку, они не смоются. В том числе прилипнет наш Белок Х. Сейчас наша цепочка короткая: Белок Х за планшет.
  3. Промываем лунку, чтобы избавиться от незакрепившихся в ней белков и небелковых молекул.
  4. Добавляем «забивку» — какие-нибудь белки, которые займут пустые места в лунке и не позволят налипнуть туда антителам (которые тоже белки!). Как правило, в качестве забивки используют обезжиренное молоко или БСА — бычий сывороточный альбумин, один из самых дешевых и при этом неиммуногенных белков.
  5. Промываем лунку от лишней забивки.
  6. Добавляем в лунку антитела к Белку Х. Теперь цепочка такова: Белок Х за планшет, антитело — за Белок Х.
  7. Промываем лунку от лишних антител.
  8. Теперь мы делаем хитрый шаг. Дело в том, что поскольку наше антитело не окрашено, мы совершенно никак не можем понять, зацепилось ли оно за Белок Х (то есть, был ли вообще Белок Х в растворе), а если зацепилось, то в каких количествах (то есть, сколько этого Белка Х налипло на лунку). Чтобы обнаружить это, мы добавим в лунку вторичные антитела — то есть антитела к антителам к Белку Х. К каждому такому антителу методом биоконъюгации пришит специальный фермент, катализирующий реакцию, в результате которой получаются цветные, хорошо заметные продукты (мы уже говорили об этом в разделе «Действующие лица»). Наша цепочка становится довольно-таки длинной: Белок Х за планшет, первичное антитело за Белок Х, вторичное антитело за первичное антитело, фермент за вторичное антитело. На самом краю цепочки болтается фермент, и его-то мы и используем спустя пару шагов.
  9. Но пока мы просто в очередной раз промываем лунку.
  10. Момент истины: мы добавляем в эту лунку субстрат для фермента. Проходит «цветная» реакция, результаты которой видны и невооруженным глазом. Но если нам важно померить количество искомого Белка Х, то мы вооружим наш глаз — засунем планшет в специальный прибор — спектрофотометр, — который в цифрах покажет, насколько сильно окрашен раствор. По интенсивности окраски раствора мы сможем вычислить концентрацию нашего Белка Х.

В принципе, можно избавиться от шагов 8 и 9, если сразу к антителам к Белку Х пришить фермент. Но вторичные антитела прекрасны тем, что «размножают» сигнал: на одно первичное антитело может налипнуть сразу несколько вторичных, и тогда можно будет «поймать» даже ничтожно маленькую концентрацию Белка Х.

Другие варианты ИФА

Это был классический вариант ИФА, а теперь рассмотрим его модификации.

Например, для детекции малых количеств антигена в пробе используют так называемый сэндвич-ИФА. В лунки планшета изначально вносят антитела, специфичные к детектируемому антигену, которые прилипают к поверхности пластика. Дальше повторяются уже известные нам шаги: добавляется антиген, а следом за ним еще одни антитела, специфичные к нему.

Конкурирующий ИФА — еще одна модификация метода, в которой исследуют концентрацию не антигена, а наоборот, антител. Если вы когда-нибудь сдавали кровь на антитела, то анализ проводили именно этим способом. В этом случае в лунки планшета, в которые нанесен антиген, добавляют исследуемые антитела (например, сыворотка крови) — назовем их «антителами А» — и антитела, помеченные ферментом, специфичным к антигену («антитела Б»).

Иммунохроматография

Иммунохроматография — очень остроумный метод обнаружения белка в анализируемой жидкости, в котором сам факт наличия жидкости используется для проведения реакции [15].

Схема иммунохроматографии

Рисунок 9. Анимированная схема иммунохроматографии. Пояснения — в тексте.

рисунок Ольги Пташник

  1. На мембрану на некотором расстоянии друг от друга нанесены: а) антитела к Белку Х, к которым пришита метка, — так называемые первичные антитела (меткой могут быть окрашенные латексные шарики, коллоидное золото, флуоресцентный белок и т.п.);б) еще одни антитела, специфичные к Белку Х (тестовая полоса) и, наконец, в) антитела к первичным антителам (контрольная полоса).
  2. Мембрану погружаем одним концом в исследуемую жидкость, с током которой Белок Х (если он, конечно, присутствует в пробе) передвигается сначала к антителам с меткой, связывается с ними и движется дальше к тестовой полосе.
  3. На тестовой полосе комплекс антиген—первичное антитело связывается с присутствующими там антителами, закрепляется и окрашивает ее.
  4. Избыток первичных антител, смытый с их места дислокации, движется дальше, к контрольной полосе, где связывается с присутствующими там антителами, останавливается и окрашивает ее.
  5. Расшифровка результатов проста: если в анализируемой жидкости есть Белок Х, то на тесте будут видны две полосы, если же белка нет — только контрольная полоса.

Иммуноблоттинг что это такое

Широко распространенный пример использования иммунохроматографии — тесты для определения беременности. Исследуемой жидкостью в них выступает моча женщины, в которой присутствует белок хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) — гормон, вырабатывающийся тканью хориона после имплантации эмбриона в стенку матки. ХГЧ движется по тест-полоске, в результате чего на ней появляются две полосы — это означает, что тест положителен, и женщина беременна.

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Информационный сайт
Adblock detector